СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ЛИПИДНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ И ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ СПЕРМИЕВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Abstract

Целью исследования является изучение возможностей применения спермиев крупного рогатого скота в качестве векторов доставки генетической конструкции CRISPR/Cas9 в ооциты для получения генно-редактированных животных. Для внедрения генетической конструкции спермии обрабатывались химическим (Lipofectamine CRISPRMAX) и физическим (электропорация) способами для создания временно проницаемой мембраны, с последующим внедрением рекомбинантной ДНК и оценкой сохранения жизнеспособности и усвоения генетическую конструкцию. Режимы электропорации и липофекция были опробованы на спермиях крупного рогатого скота для внедрения генетической конструкции CRISPR/Cas9 в ооциты для получения генно-редактированных животных. В результате проведенных экспериментов установлена эффективность применения липофекции на спермиях крупного рогатого скота, концентрация жизнеспособных спермиев и доставка генетической конструкции в половые клетки, также установлен наиболее оптимальный режим электропорации, при котором наблюдаются жизнеспособные спермии с внедренной ген-конструкцией. Полученные результаты позволили сформировать технологический регламент по геномному редактированию крупного рогатого скота с использованием спермиев в качестве вектора доставки генетических компонентов CRISPR/Cas9. Предложенный подход к геномному редактированию животных мало изучен и освещён в современной литературе. Но он имеет преимущества перед традиционными методами доставки генетической конструкции в клетки, в том числе в клетки ооцитов. Разработка технологии введения генетической конструкции для геномного редактирования методом CRISPR/Gas9 в яйцеклетки крупного рогатого скота путем переноса спермой является альтернативой использованию вирусных конструкций плазмид и метода микроинъекции.

The aim of the study is to study the possibilities of using bovine sperm as vectors for delivering the CRISPR/Cas9 genetic construct to oocytes to obtain gene-edited animals. For the introduction of the genetic construct, sperm were treated by chemical (Lipofectamine CRISPRMAX) and physical (electroporation) methods to create a temporarily permeable membrane, followed by the introduction of recombinant DNA and evaluation of viability and assimilation of the genetic construct. Electroporation and lipofection modes were tested on bovine sperm to introduce the CRISPR/Cas9 genetic construct into oocytes to obtain gene-edited animals. As a result of the experiments, the effectiveness of the use of lipofection on sperm of cattle, the concentration of viable sperm and the delivery of the genetic construct to the germ cells were established. The most optimal electroporation mode was determined, in which viable sperm with the introduced gene construct was observed. The results obtained made it possible to form a technological regulation for genomic editing of cattle using sperm as a vector for the delivery of CRISPR/Cas9 genetic components. The proposed approach to genomic editing of animals has been little studied and consecrated in modern literature. But it has advantages over traditional methods of delivering a genetic construct into cells, including oocyte cells. The development of a technology for introducing a genetic construct for CRISPR/Cas9 genome editing into bovine eggs by sperm transfer is an alternative to using viral plasmid constructs and the microinjection method.